水产动物 DNA鉴定 线粒体COI基因序列法

基础信息

标准简介

 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。 本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。 本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。 本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，鲍相勃，苏 浩。 本标准首次发布。 水产动物 DNA鉴定 线粒体COI基因序列法 1 范围 本标准规定了水产动物 DNA鉴定 线粒体COI基因序列法的原理、试剂、仪器、分析步骤和结果判定。本标准适用于水产动物DNA鉴定等方面的种质检验工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T 1193-2003 基因检验实验室技术要求 3 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。 3.1 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR) 用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热 DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。 3.2 细胞色素c氧化酶亚基I (Cytochrome Coxidase I, COI) 3.3 线粒体 (mitochondrion) 真核细胞中由双层高度特化的单位膜围成的细胞器。 3.4 DNA序列测定 (DNA sequencing) 测定DNA分子的核苷酸序列。 3.5 序列比对 (alignment) 为确定两个或多个序列之间的相似性以至于同源性，而将他们按照一定的规律排列。 4 原理 线粒体COI基因是位于线粒体DNA的蛋白质编码基因，其长度为600 bp左右易于扩增，进化速度较快同时又相对保守，既有足够的变异又便于通用引物扩增，DNA序列很少有插入与缺失现象，便于序列比对分析。利用通用引物对水产动物线粒体COI进行PCR扩增，得到目的片段进行纯化、测序，只要将所有序列进行两两比较并计算其差异值，然后根据差异值来确定物种之间的关系。 5 试剂 5.1 裂解液 5.2 核苷酸(RNA)酶 5.3 三羟甲基氨基甲烷饱和酚 (Tris饱和酚) 5.4 三氯甲烷 5.5 异戊醇 5.6 无水乙醇 5.7 溴化乙锭（10mg/mL） 5.8 10×Tris硼酸(10×TBE)电泳缓冲液 5.9 6上样缓冲液 5.10 100bp DNA 分子量标记 5.11 琼脂糖：分析纯 5.12 蛋白酶K（20mg/mL） 5.13 Taq DNA聚合酶（5 U/L） 5.14 分子量标准(markers) 5.15 超纯水 6 仪器 6.1 凝胶成像分析系统 6.2 PCR仪 6.3 低温高速离心机 6.4 稳

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